PCR yöntemi nedir? Kullanım alanları nerelerdir?
PCR (Polymerase chain reaction) ya da polimeraz zincir reaksiyonu, moleküler biyolojide uygulanan bir teknik olup, basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması olarak tanımlanabilir.
PCR, bir çeşit “in vitro klonlama”dır. PCR, reaksiyonu DNA’nın iki zincirinin yüksek isi ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon); daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanmasını (hibridizasyonu); sonra zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift iplikçikli DNA’ların sentezi) ve bu sikluslarin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adım (denatürasyon / primer bağlanması / DNA sentezi) bir PCR siklusunu oluşturur. Her adim farklı ısılarda gerçekleştirilir. (Sırasıyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C ). PCR tekniği tek veya çift iplikçikli DNA’yi; RNA’ya hedef olarak kullanabilir (Sekil 7.13, Sekil 7.14 ve Sekil 7.15). Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 arasında çoğaltmak mümkündür.
Yöntemin temeli, çogaltilmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.
PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir. PCR Teknolojisi için:
1) DNA örneği, genelde genomik DNA,
2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,
3) dNTP’ler (A,T,C,G),
4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi,
5) Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı gereklidir.
PCR KULLANIM ALANLARI:
Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında, prenatal tanıda, klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında, adli tıpta, onkogenesisin araştırılmasında, probe’larin oluşturulmasında / klonlamada / gen ekspresyon araştırmalarında, DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında, bilinmeyen dizilerin belirlenmesinde, geçmiş DNA’nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında, Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm (RFLP) Analizinde, Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanması, DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder